豬eNOS免疫組化試劑盒

該試劑盒以HRP標記的鏈霉親和素復合物（HRP Streptavidin Conjugate，HRP-SA）為基礎，可用于檢測細胞、組織內的特異性eNOS抗原。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強、定性定位準確、背景清晰。在所用的eNOS一抗與相應靶抗原結合后，用生物化二抗與一抗特異性結合，最后加入HRP-SA，形成抗原—特異一抗—生物素化二抗—HRP-SA復合物，顯微鏡下觀察成像。

試劑盒所含試劑：

試劑A 通透液：0.1% Triton-X 100   10 mL（選用）

試劑B 封閉緩沖液（封閉用） 20 mL

試劑C （原裝jin口分裝）已稀釋的即用型eNOS一抗（2.5ml）

試劑D （原裝jin口分裝）生物素化羊抗兔IgG 1支

（濃度1.5 mg/mL，稀釋比為1:300~1:500）50 μL+抗體稀釋液20ml

試劑E HRP-SA復合物1支（濃度1 μM，稀釋比1:50~1:200）100 μL

試劑F DAB顯色液 5ml

用戶自備試劑：

1． 10mM TBS（pH7.2~7.4）

三羥基氨基甲烷1.21g

氯化鈉7.6g

加蒸餾水800mL，濃鹽酸調pH值至7.2~7.4，最后定容至1000mL

TBS-T：TBS+Tween 20（0.05%體積比）

2．抗原修復液（依檢測抗原不同而選擇不同的修復液）

10mM pH6.0 檸檬酸緩沖液

檸檬酸0.38g

檸檬酸三鈉2.45g

加蒸餾水900mL，濃鹽酸調pH值至6.0，最后定容至1000mL

或：0.5M EDTA修復液（pH8.0）

EDTA·2H2O 186.1g

檸檬酸三鈉2.45g

加蒸餾水700mL，用10mM NaOH調pH值至8.0，最后定容至1000Ml

3. 緩沖甘油封固劑10 mL

4. Tween 20 5 mL

石蠟包埋組織切片免疫染色

實驗步驟（建議方案）：

石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度

1.烤片： 將待做切片置于切片架上，于60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr；

2.脫蠟： 切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min；

3.水化： 切片經下行酒精水化，無水乙醇5min，95%乙醇2次（每次2min），85%乙醇2 min；75%乙醇2min，自來水沖洗，ddH2O洗2×2min；

4.抗原修復： 根據抗體說明書推薦方法進行抗原修復，常采用高壓、微波（溫度達到98~100℃）或酶消化修復法，室溫自然冷卻，自來水沖洗，ddH2O洗2×2min，TBS洗滌（2×2min）（具體修復方法見附1）* 注：有些抗原勿需修復，直接進入第5步封閉。

5.封閉： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育30 min；

6.加一抗：滴加用試劑C（即用型一抗），37℃濕盒孵育2 hr 或4℃過夜；

7.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）；

8.封閉： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育10 min；

9.加二抗： 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗（試劑D），37℃濕盒中孵育30 min；

10.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）；

11.封閉： 滴加試劑Tween 20，37℃濕盒孵育封閉20 min；

12.加HRP-SA： 滴加用抗體稀釋液稀釋的試劑E（1：50~200，終濃度5~20 nM），37℃濕盒中孵育30 min；

13.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min），TBS洗滌（2×5 min）；

14.顯色：應用DAB溶液（試劑F）顯色；

15.復染：自來水充分沖洗，復染，脫水，透明；

16.封片： 待組織標本干后，用試劑緩沖甘油封固劑封片；

17.觀察成像： 顯微鏡下觀察成像。

注意事項：

1. 修復后緩沖液須自然冷卻，自來水沖洗后方能把切片取出，驟冷有可能導致結晶或抗原封閉。

2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復使用。

3. 若試劑為微量濃縮液，用前應低速離心，將內蓋和管壁附著的溶液離到底部。

4. 封片前一定要換用TBS充分洗滌，以便洗去組織上殘留的Tween 20，否則會影響結果觀察。

5. 如須復染細胞核，則在封片前復染或直接采用含有染核試劑的封片劑進行封片。

附1：

抗原修復方法

常用抗原修復液：檸檬酸緩沖液（0.01M pH6.0）、EDTA抗原修復液（pH8.0或9.0）等等。

一、酶消化修復法

切片脫蠟水化處理，TBS沖洗，在組織上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶，37℃孵育20~30min后TBS沖洗即可。

二、微波抗原修復法

微波盒中加入抗原修復液微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔或高檔繼續微波10~15min，取出微波盒冷卻至室溫后，自來水沖洗，取出切片。因不同微波爐微波處理時間存在差異，須自行調整。

三、直接高壓抗原修復法

取修復液于不銹鋼高壓鍋中加熱至沸騰，將組織切片置于耐高溫切片架上，修復液沸騰后放入切片架，蓋上鍋蓋，待噴氣后計時1.5~2.5min即可脫離熱源，自然冷卻至室溫后自來水沖洗，取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復。

四、隔水式高壓抗原修復法

不銹鋼高壓鍋中加自來水加熱至沸騰，微波盒中加入修復液于微波爐中加熱至沸騰，將切片放入微波盒中，再將微波盒放入高壓鍋中蓋上鍋蓋，待噴氣后計時4~8 min即可關閉熱源，自然冷卻至室溫后自來水沖洗，取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復。