土壤羥胺還原酶（hydroxylamine reductase,HR）試劑盒說明書

發(fā)布時間：2023/9/26

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微量法100T/48S

注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

土壤羥胺還原酶能將土壤中氮代謝過程中形成的中間產物羥胺還原為氨，土壤中的還原態(tài)化合物可作為氫的供體，其強弱影響到土壤氮代謝過程中氮素的氨揮發(fā)損失，間接影響氮肥的利用效率。

測定原理：

硫酸鐵銨中的Fe3+可將羥胺氧化為氮氣，自身被還原為Fe2+，Fe2+在弱酸條件下與鄰菲羅琳形成橙紅色配合物，在510nm處有吸收峰，羥胺還原酶作用于羥胺，使配合物形成量減少，510nm處吸光值的減少可反映羥胺還原酶的活性。

自備實驗用品及儀器：

天平、常溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、震蕩儀、氮吹儀。

試劑組成和配制：

試劑一：液體4mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加4mL蒸餾水充分溶解。

試劑三：液體12mL×1瓶，4℃保存。

試劑四：液體8mL×1瓶，4℃保存。

試劑五：液體4mL×1瓶，4℃保存。

試劑六：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑七：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。

樣品處理：

新鮮土樣自然風干或 37 度烘箱風干，過 30~50 目篩。

測定操作表：

	空白管	對照管	測定管
風干土樣（g）		0.02	0.02
試劑一（μL）	40		40
蒸餾水（μL）		40
試劑二（μL）	40	40	40
試劑三（μL）	120	120	120
混勻后，用N2氣流排除管中空氣，立即密封，于30℃反應1h
試劑四（μL）	80	80	80
充分震蕩10min，8000rpm，25℃，離心10min
上清液（μL）	20	20	20
試劑五（μL）	40	40	40
試劑六（μL）	20	20	20
試劑七（μL）	20	20	20
蒸餾水（μL）	100	100	100
充分混勻，25℃靜置顯色10min，用蒸餾水調零，于微量石英比色皿/96孔板測定510nm各管吸光值，分別記為A空白管、A標準管、A對照管、A測定管，△A＝A空白管－（A測定管－A對照管）。

計算公式：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線：y = 0.185x -0.1828，R2 = 0.9992

酶活定義：每克土壤每天轉化1μg羥胺為一個酶活力單位。

HR活性（μg/d /g土樣）=（△A+ 0.1828）÷ 0.185×V反總÷W÷T

= 36.32×（△A+0.1828）÷W

b. 使用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y = 0.0925x -0.1828，R2 = 0.9992

酶活定義：每克土壤每天轉化1μg羥胺為一個酶活力單位。

HR活性（μg/d /g土樣）=（△A+ 0.1828）÷ 0.0925×V反總÷W÷T

=72.64×（△A+0.1828）÷W

V反總：加入提取液體積，0.28mL；W：樣本質量，g；T：1/24h

注意事項：

1. 土壤表層溶解氧濃度較大，取樣應取表層5cm以下的土壤，否則酶活性較低或者測定不到。

2. 試劑三盡量不要敞口放置，取完立即加蓋擰緊。

3. 反應體系最好能用氮吹儀排除溶解氧，若無此裝置，則加入試劑三后立即密封，于30℃反應1h。