土壤亞硝酸還原酶（Solid-Nitrite reductase，S-NiR）試劑盒說明書

    微量法100T/48S

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

土壤亞硝酸還原酶是反硝化作用中的關鍵酶之一，參與亞硝酸鹽至NO的還原反應，它的活性反映了生物降解過程中氮素的轉化效率，為氮素轉化規(guī)律的研究提供一定的依據。

測定原理：

亞硝酸還原酶可將NO₂^—還原為NO，使樣品中參與重氮化反應生成紫紅色化合物的NO₂^—減少，即540nm處吸光值的變化可反應土壤中亞硝酸還原酶的活性。

需自備的儀器和用品：

天平、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、水浴鍋、低溫離心機。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體4mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加4mL蒸餾水溶解。

試劑三：液體4mL×1瓶，4℃保存。（如出現沉淀可以70-80℃加熱溶解）

試劑四：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。（如出現沉淀可以70-80℃加熱溶解） 

試劑五：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。

工作液：臨用前根據用量將試劑四和試劑五以1:1的比例混合。

樣品處理：

新鮮土樣自然風干或37度烘箱風干，過30~50目篩。

測定操作表：

計算公式

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線：y = 1.5562x+ 0.0088，R² = 0.996；x為標準品濃度（μmol/mL），y為吸光值（A標準管-A空白管）。

酶活單位定義：每g土樣每天還原1μmol NO₂^ˉ 的量為一個酶活力單位。

S-NiR（μmol /d /g土樣）=[A空白管-(A測定管-A對照管) -0.0088]÷1.5562×V標÷W÷T

= 0.617×[A空白管-(A測定管-A對照管) -0.0088]÷W

T：反應時間，1h=1/24d；V標：標準液體積，0.04mL；W：樣本質量，g。

b. 使用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y = 0.7781x+ 0.0088，R² = 0.996；x為標準品濃度（μmol/mL），y為吸光值（A標準管-A空白管）。

酶活單位定義：每g土樣每天還原1μmol NO₂^ˉ 的量為一個酶活力單位。

S-NiR（μmol /d /g土樣）=[A空白管-(A測定管-A對照管) -0.0088]÷0.7781×V標÷W÷T

= 1.234×[A空白管-(A測定管-A對照管) -0.0088]÷W

T：反應時間，1h=1/24d；V標：標準液體積，0.04mL； W：樣本質量，g。

注意事項：

1.        配制好的工作液3天內使用完。

2.        若吸光值超過1.5，將上清液進行適當的稀釋后再加入工作液顯色，并在計算公式中乘以稀釋倍數。

3.        嚴格控制顯色時間，否則會對結果有影響。

4.        標準曲線線性范圍為0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。

5.        A空白管-（A測定管-A對照管）線性范圍為0.02-1.5。