莽草酸脫氫酶（Shikimate dehydrogenase，SD）試劑盒說明書

                                         微量法 100管/96樣

注    意： 正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：                           

莽草酸途徑是存在于植物、真菌和微生物中的一條重要的代謝途徑，莽草酸脫氫酶是莽草酸合成途徑中的關鍵酶。

測定原理：

莽草酸脫氫酶催化莽草酸和NADP產生NADPH，檢測340nm下的吸光值增加速率來表示SD活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×2瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、   分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2、   樣本測定

（1）在試劑二中加入10mL試劑一充分溶解混勻，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min，現配現用。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑二，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

SD活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

SD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘產生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

SD（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

SD（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.286×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

SD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘產生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

SD（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

SD（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=2.572×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。