漆酶（Laccase）試劑盒說明書

                                                微量法 100T/48S

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

漆酶（CE1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，屬于銅藍氧化酶家族，廣泛分布于真菌和高等植物中，具有較強的氧化還原能力，在紙漿生物漂白，環境污染物降解和木質纖維素降解以及生物檢測方面有非常廣泛的應用。

測定原理：

漆酶分解底物ABTS產生ABTS自由基，在420nm處的吸光系數遠大于底物ABTS，測定ABTS自由基的增加速率，可計算得漆酶活性。

自備實驗用品及儀器：

天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體30mL×1瓶，4℃保存。

工作液：粉劑×1瓶，4℃避光保存，臨用前加15mL試劑一溶解；用不完的試劑4℃保存一周。

酶液提取：

1．   組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。12000g 4℃離心30min，取上清，置冰上待測。

2．   細胞：按照細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測。

3．   細胞培養液：直接檢測。

測定操作表：

注意：

1、   極少數樣本在60℃水浴20min后會出現沉淀，可經過8000g 25℃離心10min后，取上清檢測，例如成

      熟的水稻葉片樣本。

2、   為確保檢測準確性，若ΔA大于1，將樣本用提取液稀釋2~10倍后重新檢測，計算公式乘以相應稀釋倍數。

酶活性計算公式：

a．用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 9.26×△A÷Cpr

2．按照樣本質量計算

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /g 鮮重）= ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 9.26×△A÷W

3．按照細胞數量計算

酶活性定義：每10⁴個細胞每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /10⁴ cell）= ×V反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T= 9.26×△A÷細胞數量

4．按照液體體積計算

酶活性定義：每升培養液每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /L）= ×V反總÷V樣÷T= 9260×△A

ε：ABTS毫摩爾消光系數：36L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應總體積，0.3mL；V樣：反應體系中樣本體積，0.03mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質量，g；T：反應時間，20min

b. 用96孔板測定的計算公式如下

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 18.52×△A÷Cpr

2．按照樣本質量計算

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /g 鮮重）= ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 18.52×△A÷W

3．按照細胞數量計算

酶活性定義：每10⁴個細胞每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /10⁴ cell）= ×V反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T

= 18.52×△A÷細胞數量

4．按照液體體積計算

酶活性定義：每升培養液每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /L）= ×V反總÷V樣÷T= 18520×△A

ε：ABTS毫摩爾消光系數：36L/mmol/cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V反總：反應總體積，0.3mL；V樣：反應中樣本體積，0.045mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質量，g；T：反應時間，20min