抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測(cè)定試劑盒說明書

                                               微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

APX是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗壞血酸代謝的關(guān)鍵酶之一。APX具有多種同功酶，分別定位于葉綠體、胞質(zhì)、線粒體、過氧化物和乙醛酸體，以及過氧化體和類囊體膜上。APX 催化H₂O₂氧化AsA，是植 AsA 的主要消耗者。APX的活性直接影響到AsA的含量，APX與AsA具有一定的負(fù)相關(guān)性。

測(cè)定原理：

APX 催化H₂O₂氧化AsA，通過測(cè)定AsA氧化速率，來計(jì)算得APX活性。

自備儀器用品：

低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、移液槍、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加3 mL蒸餾水充分溶解。

試劑三：液體3mL×1支，4℃保存。

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。13000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測(cè)。

測(cè)定：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到290nm，用蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一在25℃中預(yù)熱30min。

3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、140μL預(yù)熱的試劑一20μL試劑二和20μL試劑三，迅速混勻后在290nm測(cè)定10s和130s光吸收A1和A2，△A=A1-A2。

APX活性計(jì)算：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1)  按樣本蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d）×V反總×10⁹÷(Cpr×V樣)÷T

=1786×△A÷ Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：每g組織每分鐘氧化1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。

APX(nmol/min/g 鮮重 ) = △A÷(ε×d）×V反總×10⁹÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1786×△A ÷W

ε：AsA在290nm處摩爾吸光系數(shù)為2.8×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑（cm），1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×10^-4 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），20μL=0.02mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），2min。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1)  按樣本蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d）×V反總×10⁹÷(Cpr×V樣)÷T

=3571×△A÷ Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：每g組織每分鐘氧化1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。

APX(nmol/min/g 鮮重) = △A÷(ε×d）×V反總×10⁹÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=3571×△A ÷W

ε：AsA在290nm處摩爾吸光系數(shù)為2.8×10³ L/mol/cm；d：96孔板光徑（cm），0.5 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×10^-4 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），20μL=0.02mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），2min。

注意事項(xiàng)：

配制好的試劑二4℃保存，并且3天內(nèi)使用完。