線粒體復合體Ⅳ試劑盒說明書

                                          微量法100管/96樣

注   意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

線粒體復合體Ⅳ又稱細胞色素C氧化酶，也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負責催化還原型細胞色素C的氧化，并最終把電子傳遞給氧，生成水。

測定原理：

還原型細胞色素C在550nm有特征光吸收，線粒體復合體Ⅳ催化還原型細胞色素C生成氧化型細胞色素C，因此550nm光吸收下降速率能夠反映線粒體復合體Ⅳ酶活性。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：液體20mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：液體1.5mL×1瓶，-20℃保存；

試劑四：液體20mL×1瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1支，-20℃保存；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、   準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、   將勻漿600g，4℃離心5min。

3、   棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11100g，4℃離心10min。

4、   上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅳ（此步可選做）。

5、   步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復30次），用于復合體Ⅳ酶活性測定。

測定步驟：

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至550nm，蒸餾水調零。

2、  樣本測定

（1）工作液的配制：臨用前將試劑五和試劑六依次轉移到試劑四中混合溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL樣本和200μL工作液，混勻，記錄550nm處初始吸光值A1和 37℃反應30min后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

注意點：

1、若ΔA大于0.2，需將樣本用試劑二稀釋適當倍數（計算公式中乘以相應稀釋倍數），使A1-A2小于0.2，可提高檢測靈敏度。

2、動物肝臟樣本由于酶活性過高， 1分鐘內吸光值就會到達平臺期，務必先進行2個樣本的預測定。可將樣本用試劑二稀釋10~50倍，反應時間縮到到30秒或1分鐘（計算公式中代入實際反應時間，并乘以相應稀釋倍數）。其他樣本可按照正常測定步驟進行。

復合體Ⅳ活力單位的計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化降解1 nmol 還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

 復合體Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=19.20×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化降解1nmol 還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

 復合體Ⅳ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=3.88×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化降解1nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

復合體Ⅳ活力(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.008×ΔA

V反總：反應體系總體積，2.2×10^-4 L；ε：細胞色素C摩爾消光系數，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500萬。

b.使用96孔板測定的計算公式如下：

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化降解1 nmol 還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

 復合體Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=38.39×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化降解1nmol 還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

 復合體Ⅳ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=7.76×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化降解1nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

復合體Ⅳ活力(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.016×ΔA

V反總：反應體系總體積，2.2×10^-4 L；ε：細胞色素C摩爾消光系數，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500萬。