黃嘌呤氧化酶（xanthione oxidase, XOD）試劑盒說明書

                                         微量法100管/96樣

注   意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

XOD（EC 1.17.3.2）催化黃嘌呤氧化生成尿酸和超氧陰離子，是活性氧主要來源之一；同時也是核苷酸代謝的關鍵酶之一。XOD主要分布于哺乳動物的心，肺，肝臟等組織中，當肝功能受損時，XOD大量釋放到血清中，對肝損害的診斷具有特異性的意義。

測定原理：

XOD催化黃嘌呤產(chǎn)生尿酸，尿酸在290nm下有特征吸收峰。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：30mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×2瓶，4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

操作步驟：

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至290nm，蒸餾水調零。

2、   XOD檢測工作液的配制：用時在每瓶試劑二中加入15mL試劑一，充分混勻，待用；現(xiàn)配現(xiàn)用；

3、   測定前將XOD檢測工作液在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

4、   準備96孔UV板一塊（非普通酶標板，普通酶標板只能透過可見光，不能透過紫外光，檢測波長小于340nm務必使用UV板）。

5、在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL樣本和250μL工作液，立即混勻并計時，記錄290nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。計算ΔA＝A2-A1。

XOD活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）XOD計算：

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。

XOD（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=2131×ΔA

2、組織、細菌或細胞中XOD計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。

XOD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr)÷T =2131×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。

XOD（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T=2131×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每一萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。

XOD（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=4.26×ΔA

V反總：反應體系總體積，2.6×10^-4 L；ε：尿酸摩爾消光系數(shù)，1.22×10⁴ L/ mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，1 min；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）XOD計算：

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。

XOD（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=4262×ΔA

2、組織、細菌或細胞中XOD計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。

XOD（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr)÷T =4262×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。

XOD（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =4262×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每一萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個酶活力單位。

XOD（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=8.52×ΔA

V反總：反應體系總體積，2.6×10^-4 L；ε：尿酸摩爾消光系數(shù)，1.22×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，1 min；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。