多胺氧化酶（Polyamine oxidase，PAO）試劑盒說明書

                                         微量法100管/96樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：                           

多胺氧化酶是催化生物體內(nèi)多胺氧化的關(guān)鍵酶，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)多胺水平和生成物的濃度，參與各種植物體對(duì)逆境脅迫的反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育過程。

測(cè)定原理：

PAO催化多胺氧化產(chǎn)生過氧化氫，在過氧化物酶存在的條件下與底物顯色，在550nm下有特征吸收峰，通過測(cè)定吸光值增加速率來反映PAO活性。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體3mL×1瓶，4℃保存；

試劑三：液體1.5mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：液體1.5mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.        血清等液體：直接測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、   酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm。

2、   樣本測(cè)定

PAO活性計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A550變化0.001為一個(gè)酶活力單位。

PAO（U/mg prot）＝ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.001÷T =333.33×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A550變化0.001為一個(gè)酶活力單位。

PAO（U/g 鮮重）＝ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.001÷T =333.33×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A550變化0.001為一個(gè)酶活力單位。

PAO（U/10⁴ cell）＝ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.001÷T =0.667×ΔA

（4）按液體體積計(jì)算

單位的定義：每mL液體樣本在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A550變化0.001為一個(gè)酶活力單位。

PAO（U/mL）=ΔA×V反總÷V樣÷0.001÷T =333.33×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；V樣：加入樣本體積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。