二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）試劑盒說明書

                                                     微量法100T/48S

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

DAO(EC1.4.3.6)廣泛存在于動物（腸粘膜、肺、肝臟、腎臟等）、植物和微生物中。催化多胺氧化為醛，其活性與核酸和蛋白合成密切相關，能夠反映腸道機械屏障的完整性和受損傷程度。

測定原理：

DAO催化尸胺產生醛和過氧化氫，外源添加過量的辣根過氧化物酶，催化過氧化氫氧化鄰聯茴香胺生成氧化型鄰聯茴香胺，在460nm處有特征吸收峰，通過測定該波長吸光度增加速率，計算DAO活性。

自備實驗用品及儀器：

天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體120mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體0.3mL×1支，4℃保存。

試劑二：液體2.5mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體1.2mL×1管，4℃保存。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測。

2.        細菌、真菌：按照細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體：直接測定。

測定操作表：

1、分光光度計/酶標儀預熱30min，調節波長至460nm，蒸餾水調零。

2、操作表

酶活性計算公式：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化產生1nmol H₂O₂所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

DAO活性（nmol/min/mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 18×A₄₆₀÷Cpr

（2）按樣本質量計算：

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每克組織每分鐘催化產生1nmol H₂O₂所需的酶量定義為一個酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/g 鮮重）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T= 18×A₄₆₀÷W

（3）按細胞數量計算：

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每10⁴個細胞每分鐘催化產生1nmol H₂O₂所需的酶量定義為一個酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/10⁴cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數量）÷T= 18×A₄₆₀÷細胞數量

(4) 按液體體積計算

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫升血清每分鐘催化產生1nmol H₂O₂所需的酶量定義為一個酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/mL）= ×V反總÷V樣÷T= 18×A₄₆₀

ε：氧化型鄰聯茴香胺毫摩爾消光系數：7.5 L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應總體積，0.2mL；V樣：反應中樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，30min

b. 用96孔板測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化產生1nmol H₂O₂所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

DAO活性（nmol/min/mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 36×A₄₆₀÷Cpr

（2）按樣本質量計算：

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每克組織每分鐘催化產生1nmol H₂O₂所需的酶量定義為一個酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/g 鮮重）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T= 36×A₄₆₀÷W

（3）按細胞數量計算：

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每10⁴個細胞每分鐘催化產生1nmol H₂O₂所需的酶量定義為一個酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/10⁴cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數量）÷T= 36×A₄₆₀÷細胞數量

(4) 按液體體積計算

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫升血清每分鐘催化產生1nmol H₂O₂所需的酶量定義為一個酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/mL）= ×V反總÷V樣÷T= 36×A₄₆₀

ε：氧化型鄰聯茴香胺毫摩爾消光系數：7.5 L /mmol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應總體積，0.2mL；V樣：反應中樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，30min

注意事項：

1、如果OD值小于0.01，適當加大提取用樣本量；OD值大于0.8，粗酶液可適當稀釋，或者減少提取用樣本量。

2、樣品蛋白質含量需要另外測定。