離子結(jié)合型果膠(ISP)含量試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                                              微量法 100管/48樣

注    意：正式測(cè)定前取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

果膠是構(gòu)成細(xì)胞初生壁和中膠層的主要成分，主要由原果膠、果膠酸甲酯和果膠酸組成。果膠中含有半乳糖醛酸、乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等，是許多高等植物細(xì)胞壁中含量Z豐富的多糖成分，其du特的物理、化學(xué)性質(zhì)影響著植物源食品的口感和品質(zhì)。果膠間以Ca²⁺橋及其他離子鍵、氫鍵、糖苷鍵、酯鍵和苯環(huán)偶聯(lián)的方式交聯(lián)，通過(guò)不同的抽提方法可以提取各種形式的果膠，如水溶性果膠（WSP）、離子結(jié)合型果膠（ISP）和共價(jià)結(jié)合果膠（CSP）。

測(cè)定原理：

利用帶有螯合劑的酸溶液提取離子結(jié)合型果膠（ISP），采用咔唑比色法測(cè)定果膠含量。果膠水解成半乳糖醛酸，在硫酸溶液中與咔唑試劑進(jìn)行縮合反應(yīng)，生成物質(zhì)在530 nm處有最大吸收峰。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、80％乙醇、丙酮、濃硫酸（不允許快遞）、研缽和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體100mL× 1瓶，4℃保存。

試劑二：液體100mL× 1瓶，4℃保存。

試劑三：標(biāo)準(zhǔn)液1mL× 1支，4℃保存。

試劑四：液體5 mL× 1瓶，4℃保存；

樣品的前處理：

1、   細(xì)胞壁的提取：取約0.3g樣本，加入1mL 80％乙醇，室溫快速勻漿，95℃水浴20min，冷卻至室溫，4000g 25℃離心10min，棄上清。沉淀加入1.5mL80％乙醇和丙酮各洗一遍（渦旋振蕩2min左右，4000g 25℃離心10min，棄上清即可），沉淀即為粗細(xì)胞壁，加入1mL試劑一（去除淀粉）浸泡15小時(shí)，4000g 25℃離心10min，棄上清，將沉淀干燥，稱重得細(xì)胞壁物質(zhì)（CWM）。

2、   ISP的提取：稱取烘干的CWM 3mg，加入1mL試劑二，充分勻漿(若烘干物質(zhì)質(zhì)地堅(jiān)硬，可先研碎后再加入1mL試劑二勻漿，或者用勻漿器勻漿)。8000g 4℃離心10min，取上清液待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至530nm處，蒸餾水調(diào)零；試劑三和試劑四37℃預(yù)熱10min以上；

2、操作表：

 混勻  

混勻，95℃水浴5min后，冷卻至室溫，取200µL 至微量石英比色皿或96孔板中，530nm處讀取吸光值，空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、對(duì)照管和測(cè)定管吸光值分別記為A1、A2、A3和A4。若A大于2，需將待測(cè)樣本用蒸餾水稀釋（可稀釋10倍或20倍）。空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管，每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

ISP含量計(jì)算：

ISP含量(mg /g 干重)= (C標(biāo)準(zhǔn)×V1) ×(A4-A3)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2) ×稀釋倍數(shù)=0.05×(A4-A3)÷(A2-A1)÷W×稀釋倍數(shù)

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.05mg/mL；V1：加入樣本體積，0.05mL；V2：加入提取液體積，1mL； W：樣本干重，g。

注意：Z低檢測(cè)限為50μg /g 干重

離子結(jié)合型果膠(ISP)含量試劑盒僅供科研！