亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）試劑盒說(shuō)明書(shū)

 微量法100T/48S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

硝酸還原酶（NiR）是一類(lèi)能催化亞硝酸鹽還原的酶，廣泛存在于微生物及植物體內(nèi)，是自然界氮循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶，可以將亞硝酸鹽降解為NO或NH3，從而減少環(huán)境中亞硝態(tài)氮的積累，降低因亞硝酸鹽累積而造成的對(duì)生物體的毒害作用。

測(cè)定原理：

亞硝酸還原酶可將NO₂^—還原為NO，使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO₂^—減少，即540nm處吸光值的變化可反映亞硝酸還原酶的活性。

需自備的儀器和用品：天平、研缽、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、水浴鍋、低溫離心機(jī)。

試劑的組成和配制：

提取液：液體112mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體4mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加5mL蒸餾水溶解。

試劑三：液體5mL×1瓶，4℃保存。（如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解）

試劑四：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。（如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解）  

試劑五：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。

工作液：臨用前根據(jù)用量將試劑四和試劑五以1:1的比例混合。

酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2．細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

測(cè)定操作表：

計(jì)算公式：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y = 1.3594x + 0.0072，R² = 0.9997；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為吸光值（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）。

1．按照蛋白含量計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時(shí)還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR（μmol/h /mg prot）= [A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)-0.0072]÷1.3594×V標(biāo)÷（V樣×Cpr）÷T = 1.47×（A空白管-A測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072）÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每小時(shí)還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR（μmol/h/g 鮮重）=[A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)-0.0072]÷1.3594×V標(biāo)÷（W ×V樣÷V樣總）÷T = 1.47×（A空白管-A測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072）÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每小時(shí)還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR（μmol/h /10⁴ cell）= [A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)-0.0072]÷1.3594×V標(biāo)÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T = 1.47×（A空白管-A測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072）÷細(xì)胞數(shù)量

V標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)液體積，0.04mL；V樣：體系中加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質(zhì)量，g

b. 使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y = 0.6797x + 0.0072，R² = 0.9997；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為吸光值（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）。

1．按照蛋白含量計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時(shí)還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR（μmol/h /mg prot）= [A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)-0.0072]÷0.6797×V標(biāo)÷（V樣×Cpr）÷T = 2.94×（A空白管-A測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072）÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每小時(shí)還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR（μmol/h/g 鮮重）=[A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)-0.0072]÷0.6797×V標(biāo)÷（W ×V樣÷V樣總）÷T = 2.94×（A空白管-A測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072）÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每小時(shí)還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR（μmol/h /10⁴ cell）= [A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)-0.0072]÷0.6797×V標(biāo)÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T = 2.94×（A空白管-A測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072）÷ 細(xì)胞數(shù)量

V標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)液體積，0.04mL；V樣：體系中加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質(zhì)量，g

注意事項(xiàng)：

1.        配制好的工作液3天內(nèi)使用完。

2.        若吸光值超過(guò)1.5，將上清液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤偌尤牍ぷ饕猴@色，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3.        嚴(yán)格控制顯色時(shí)間，否則會(huì)對(duì)結(jié)果有影響。

4.        標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍為0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。

5.        A空白管-（A測(cè)定管-A對(duì)照管）線(xiàn)性范圍為0.02-1.5。