谷胱甘肽還原酶（GR）活性測定試劑盒說明書

                                               微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

GR是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，是谷胱甘肽氧化還原循環的關鍵酶之一（通常昆蟲中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH還原GSSG生成GSH，有助于維持體內GSH/GSSG比值。GR在氧化脅迫反應中對活性氧清除起關鍵作用，此外GR還參與抗壞血酸－谷胱甘肽循環途徑。

測定原理：

GR能催化NADPH還原GSSG再生GSH，同時NADPH脫氫生成NADP⁺；NADPH在340 nm有特征吸收峰，相反NADP⁺在該波長無吸收峰；通過測定340 nm吸光度下降速率來測定NADPH脫氫速率，從而計算GR活性。

自備儀器和用品：

低溫離心機、水浴鍋、移液器、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、和蒸餾水

試劑組成和配置：

試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×2支，-20℃保存。臨用前加入1.2mL蒸餾水，混勻。

試劑三：粉劑×2支，-20℃保存。臨用前加入0.6mL蒸餾水，混勻。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測。

2.        細菌、真菌：按照細胞數量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心15min，取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體：直接測定。

操作步驟：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調節波長到340 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑一置于25℃（普通物質）或者37℃（哺乳動物）中預熱30min。

3. 測定管：取微量石英比色皿或96孔板，依次加入10μL試劑三，20μL試劑二，150μL試劑一，20μL上清液，混勻，于340nm迅速測定初始吸光度和180 s吸光度，記為A測1和A測2，△A測定管= A測1﹣A測2。

注 意：

1.加完上清液后必須迅速混勻測定，保證準確測出初始反應速度；

2.當出現初始180s內吸光值不穩定時，可以適當延長反應時間，選取相對穩定的時間段內吸光值變化值；

3.當所測△A測定管的值在零點附近徘徊時，可能原因：（1）樣本GR酶活性低，建議濃縮樣本后再進行測定；（2）樣本GR酶活性過高，吸光值變化區間過小無法準確測出，建議樣本稀釋2~5倍后再進行測定)

計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。

GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×10⁹]÷[Cpr×V樣]÷T

= 536×△A測定管÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每克樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。

GR酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×10⁹] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 536×△A測定管÷W

(3) 按細胞數量計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每10⁴個細胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。

GR酶活(nmol/min/10⁴ cell)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×10⁹] ÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T           

= 536×△A測定管÷細胞數量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。

GR酶活(nmol/min/mL)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×10⁹]÷×V樣÷T

= 536×△A測定管

ε：NADPH摩爾消光系數6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應體系總體積，200μL=2×10^-4 L；10⁶：1 mol=1×10⁶μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質量；V樣：加入反應體系中上清液體積，20μL =2×10^-2 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應時間，3 min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。

GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×10⁹]÷[Cpr×V樣]÷T

= 1072×△A測定管÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每克樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。

GR酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×10⁹] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 1072×△A測定管÷W

(3) 按細胞數量計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每10⁴個細胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。

GR酶活(nmol/min/10⁴ cell)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×10⁹] ÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T           

=1072×△A測定管÷細胞數量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。

GR酶活(nmol/min/mL)= [ (△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×10⁹]÷×V樣÷T

=1072×△A測定管

ε：NADPH摩爾消光系數6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應體系總體積，200μL=2×10^-4

L；10⁶：1 mol=1×10⁶μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質量；V樣：加入反應體系中上清液體積，20μL =2×10^-2 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應時間，3 min。

注意事項：

（1）樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力，勻漿液避免反復凍融；

（2）試劑二和試劑三須現配現用，配制完后，置于冰上，未使用完的4℃保存，三天內使用完。

（3）測定前須先用1～2個樣做預實驗，哺乳動物組織一般須用試劑一稀釋2～5倍。

（4）細胞中GR活性測定時，細胞數目須在300萬-500萬之間，細胞中GR的提取時可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞。