還原型谷胱甘肽（reduced glutathione, GSH）試劑盒說明書

 微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

GSH是細胞內最主要的抗氧化巰基物質，在抗氧化、蛋白質巰基保護和氨基酸跨膜運輸等中具有重要作用。還原型與氧化型比值（GSH/GSSG）是細胞氧化還原狀態的主要動態指標。因此，測定細胞內GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能夠很好地反映細胞所處的氧化還原狀態。

測定原理：

DTNB與GSH反應生成復合物，在412nm處有特征吸收峰；其吸光度與GSH含量成正比。

自備儀器和用品：

低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體×1瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2.        細菌、真菌：按照細胞數量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體：直接測定。

GSH測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min，調節波長到412 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）水浴中保溫30min。

3. 空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μL蒸餾水，140μL試劑二，40μL試劑三，混勻靜置2min后測定412 nm吸光度A1。

4. 測定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μL上清液，140μL試劑二，40μL試劑三，混勻靜置2min后測定412 nm吸光度A2。

注意：空白管只需要測定一次。

GSH含量計算公式：

GSH標準曲線公式：y=1.5 x（x為GSH濃度，μ mol /mL；y為吸光值）

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

GSH（μ mol/ mg prot）=(A2－A1) ÷1.5×V樣÷（V樣×Cpr） =0.667×(A2－A1) ÷Cpr

（2）按樣本質量計算

GSH（μ mol/g 鮮重）=(A2－A1) ÷1.5×V樣÷(V樣÷V樣總×W)=0.667×(A2－A1) ÷W

（3）按細胞數量計算

GSH（μ mol /104 cell）=(A2－A1) ÷1.5×V樣÷(V樣÷V樣總×細胞數量)=0.667×(A2－A1) ÷細胞數量

（4）按液體體積計算

GSH（μ mol/ mL）=(A2－A1) ÷1.5×V樣÷V樣 =0.667×(A2－A1)

V反總：反應總體積，0.2mL；V樣總：上清液總體積，1 mL；V樣：加入反應體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量

b.使用96孔板測定的計算公式如下

GSH標準曲線公式：y=0.75x（x為GSH濃度，μ mol /mL；y為吸光值）

（1）按蛋白濃度計算

GSH（μ mol/ mg prot）=(A2－A1) ÷0.75×V樣÷V樣÷Cpr =1.334×(A2－A1) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

GSH（μ mol/g 鮮重）=(A2－A1) ÷0.75×V樣÷(V樣÷V樣總×W)=1.334×(A2－A1) ÷W

（3）按細胞數量計算

GSH（μ mol /104 cell）=(A2－A1) ÷0.75×V樣÷(V樣÷V樣總×細胞數量)=1.334×(A2－A1) ÷細胞數量

（4）按液體體積計算

GSH（μ mol/ mL）=(A2－A1) ÷0.75×V反總÷V樣 =1.334×(A2－A1)

V樣總：上清液總體積，1mL；V樣：加入反應體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量，g。

注意事項：

1.        試劑一中含有蛋白質沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。

2.        Z低檢出限為0.011mmol/L。